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免疫组化常见问题集锦
泉源:本站 点击数:609次 更新工夫:2016-01-02 23:33:38

1 、白腊切片和冰冻切片的对照?

1)要求做冰冻切片的不一定能做白腊切片,由于做白腊切片时要高温烤片,可能会损坏构造的抗原性,若是构造的抗原性较稳固,则可作白腊切片;然则要求做白腊切片的,可做冰冻切片。

2)冰冻切片的长处是可以或许较好的生存构造的抗原免疫活性,做免疫组化时不需抗原修复那一步。瑕玷是细胞内易构成冰晶而损坏细胞构造,可能会使抗原弥散;切片厚度较白腊的薄,做的电影出白腊的时兴。当您买一抗时,目次上都写着做什么样的切片,若是它写着只能做冰冻,便不克不及做白腊,如写着二者皆可,那就都能做。

3)白腊切片的长处能够连结组织细胞的形状构造,且轻易寄存正在室温,而冰冻切片对照贫苦,一定要存在-80 度的高温冰箱中,尤其是用来做原位杂交的的切片,为了防备RNA降解,生存一向很重要。因为白腊切片能够切到 4 微米阁下,以是原位杂交探针轻易渗出到构造中去,轻易胜利,并且获得的色彩/形状皆较冰冻切片好。

 

2、一抗的挑选要点和技能是什么?

1)单克隆和多克隆抗体的挑选。由一种克隆发生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目的明白天取单一的特异抗原决意簇联合,便像导弹准确天掷中目的一样。另一方面,纵然是同一个抗原决意簇,正在机体内也能够由好几种克隆去发生抗体,构成好几种单克隆抗体混同物,称为多克隆抗体。正在抗原抗体回响反映中,一样平常单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对便低;而多克隆抗体特异性稍强,但抗体的亲和力强,灵敏度下,但易泛起非特同性染色(能够经由过程关闭等制止)。

2)运用局限的挑选。有的一抗只能用于Western blotting,或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等;以至注解白腊切片或冰冻切片。

3)种属回响反映性的挑选(species reactivity)。这一点很重要,注解这类抗体能够存在种属差

同,且这类抗体合适检测哪各种属植物体内的抗原。

(4)种属泉源,一样平常兔泉源的多是多克隆;而小鼠泉源的多是单克隆,但也有别的。凭据此泉源去挑选响应的二抗。

 

3、正在甚么状况下运用TritonX-100

1Triton X-100 化学称号为聚乙二醇辛基苯基醚,是一种去污剂。正在免疫组织化学(>10um

薄切片) 和免疫细胞化学中一样平常用Triton X-100 作为细胞通透剂,正在膜上打孔。

2)其感化道理:Triton X-100 能够消融细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂量而使抗体及大分子构造的物资进入胞浆和胞核内,故正在细胞免疫组化时尤其推荐运用,如许抗体便能顺遂进入胞内取响应抗原联合。

3)Triton X-100 既是一种表面活性剂,也有抗氧化感化

 

4 、关闭血清的挑选原则是什么?

1)膜上或切片上有盈余的位点能够非特同性吸附抗体,形成后续效果的假阳性!

2)关闭血清一样平常是和二抗统一泉源的,血清中植物本身的抗体,预先能和构造中有交织回响反映的位点发作联合,不然在后面的步调中若是和二抗发作联合,会形成配景。

3)也能够用小牛血清、BSA、羊血清等,但不克不及取一抗泉源同等。

 

5、抗体孵育前提的对照?

1)一抗孵育温度有几种:4 度、室温、37 度,个中 4 度结果最好;孵育工夫:那取温度、抗体浓度有关,一样平常 37 1-2h,而 4 渡过夜和从冰箱拿出后 37 度复温 45min

2)二抗一样平常室温或 37 30min-1h,详细工夫需求探索。

 

 

6 、一抗度孵育后为何要停止 37  度复温?

1)一方面,防备切片从 4 度间接放入PBS易脱片;

2)另一方面,使抗原抗体联合更稳固。一样平常不需要,但对表达较强的抗原能够有效,4 度和 37度时分子活动体式格局差别,前者份子碰撞机率和活动速度小于后者,后者联合更快,但敏感性也进步了并易形成非特异染色。

3)实在,我更赞许后一种说法,由于我实验把肝脏或睾丸电影从 4 渡过夜拿出后,间接用PBS洗出发作过脱片征象。事实胜于雄辩!

 

7 DAB 显色工夫怎样掌握?

1DAB显色工夫不是流动的,重要由显微镜下掌握显色工夫,到泛起浅棕色本底时便可冲刷;

2DAB显色工夫很短(如几秒或几十秒)便泛起很深的棕褐色,那很可能阐明您的抗体浓度过高或抗体孵育工夫过长,需求下调抗体浓度或收缩您的抗体孵育工夫;

3)另外,若很短时间便泛起配景很深,借有可能您前面的关闭非特同性卵白不全,需求延伸关闭工夫;

4DAB显色工夫很少(如凌驾十几分钟)才泛起阳性染色,一方面能够阐明您的抗体浓度过低或孵育工夫过短(最好一抗 4 渡过夜);另一方面就是关闭工夫过长。

 

8 、免疫组化效果怎样剖析?

1)阳性着色细胞计数法。正在 40*光镜下,随机挑选不堆叠的 10 个视野,野生或机械计数阳性着色细胞,每组 3~6 张差别植物构造切片,然后停止组间对照便可。

2)灰密度剖析法。经由过程正在差别组别和差别植物构造切片上挑选雷同地区、雷同条件下用image停止灰密度剖析,然后停止统计分析便可。

3)评分法。经由过程正在光学显微镜下对构造切片离别按染色水平(0~3 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性局限停止评分(1~4 分为 0~25%26~50%51~75%76~100%),

终究能够分数相加,再停止对照。

关于以上这几种要领,各有利弊,请仔细挑选。要想得到准确效果的条件是您要做出着色匀称、配景很浅的下质量切片。

 

9 、正在甚么状况下停止构造抗原修复,抗原修复的前提是什么?

1)因为构造中部分抗原正在甲醛或多聚甲醛流动历程中,发作了卵白之间交联及醛基的关闭感化,从而落空抗原性。经由过程抗原修复,使得细胞内抗原决意族从新袒露,进步抗原检测率。

2)修复要领从强到弱一样平常分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为多少种(详细的能够查阅相干材料,大量的:中性的、下pH的等)。

3)微波修复,我们一样平常用 6min*4 次,结果不错。

 

10 、内源性过氧化物酶的灭活工夫和浓度是什么?

1)一样平常 3%过氧化氢灭活工夫短点,能够 10min阁下;而 0.3%过氧化氢则能够恰当延伸关闭工夫,一样平常 10~30min

2)用甲醇设置过氧化氢比双蒸水或PBS能够幸亏珍爱抗原和流动构造感化,过氧化氢孵育工夫过长易引发脱片.

3)现用现配,配好后 4 度避光生存。

 

11 、如何才能充裕脱蜡?

1)蜡不溶于火,若是脱蜡不清洁,少量蜡存留于切片上,将会引发染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、配景染色增添等。为了处理上述的题目,切片正在染色前必需完全脱蜡,现在用于脱蜡的试剂重要是二甲苯,果它脱蜡力强,脱蜡工夫较短;

2)脱蜡的工夫要凭据时节,室温和试剂的新颖碰面是正在差别。若是正在炎天,室温较下,脱蜡试剂也新颖,则脱蜡工夫不需许多,3-5 分钟便已充足。若是正在冬季,室温较低,脱蜡试剂也较陈腐,则脱蜡工夫需求延伸,10-20 分钟或更长。

3)当天切的切片,烧烤 2 小时后停止染色,切片带有温度停止脱蜡这将可减速脱蜡的历程,若是预先切好烤好的切片,正在染色前,借必需对切片停止加温 10-20 分钟,然后再行脱蜡,如许脱蜡速度加速,结果魁梧更好。

总之,操纵时应凭据差别的时节,差别的室温,差别的试剂去决意,脱蜡的工夫,原则上是要完全、清洁、完整天脱去切片上的蜡。

 

12 、怎样最大限度天低落构造非特同性染色?

1)收缩一抗/二抗孵育工夫、稀释抗体去掌握。那是最重要的一条。

2)一抗用多克隆抗体易泛起非特同性着色,发起试用单克隆抗体看看。

3)内源性过氧化物酶和生物素正在肝脏、肾脏等构造含量很下(露血细胞多的构造),需求经由过程延伸灭活工夫和增添灭活剂浓度去低落配景染色;

4)非特同性组分取抗体联合,那需求经由过程延伸二抗泉源的植物免疫血清关闭工夫和恰当增添浓度去增强关闭结果;

5)收缩DAB孵育工夫或低落DAB浓度/过氧化氢浓度等;

6)恰当增添PBS冲刷次数和浸洗工夫,正在一抗、二抗或SP孵育以后的浸洗尤其主要;

7)防备标本染色历程中泛起干片,那轻易加强非特同性着色。

 

13 、苏木素复染工夫的掌握?

1)苏木素复染工夫要看事先的室温、溶液的新旧、目的抗原的定位等状况,一样平常数秒-数分钟。

不外这个若是染色不幻想能够弥补的。即:染色深则分化工夫稍长些便可;染色浅则再置于苏木素中染色便可。

2)盐酸酒精是分化,氨水是返兰。感化差别。电影复染完后流水振洗,然后置于盐酸酒精中数秒(肯定行动要快)后拿出流水振洗,正在放入氨水中返兰便可。

3)若是分化的色彩过浅,能够复置于苏木素中染色。

 

14 PBS 的洗濯体式格局挑选、次数和工夫的挑选?

1)零丁冲刷,防备交织回响反映形成净化。

临床上天天检测的病例许多,所用的抗体品种及项目也多,若是正在到场一抗孵育完后,将它们正在一个缸内洗,如许便会形成交织净化,影响最初的效果。准确的做法是零丁天停止冲刷,冲刷的PBS为一次性,包管切片没有互相交织净化的时机。

2)温顺冲刷,防备切片的脱落。

冲刷切片,掏出切片,将PBS从上轻轻地冲刷,让PBS自上而下流下去,不要拿起切片将PBS瞄准切片冲刷,如许因为冲出的PBS有肯定的冲击力,很容易使切片周边引发松动,致使切片的脱落。

3)冲刷的工夫要充足,才气完全洗去联合的物资。

冲刷切片有人提出用微振荡器振染,振下未联合的种种物,使之不发生配景,此种做法一是虚耗工夫,二是很容易致使切片的脱落。切片的冲刷据实践以为,用一小烧杯温和天于切片上冲刷,便能完全冲刷去已联合的物资,无需附加别的前提,冲刷好于切片上再注入PBS,连续 2 分钟阁下便完整充足了。

4PBSPH和离子强度的运用和要求。

刘彦仿指出:中性及弱硷性前提(PH78)有利于免疫复合物的构成,而酸性前提则有利于剖析;低离子强度有利于免疫复合物的构成,而下离子强度则有利于剖析。[]免疫组化P56 我们现在常用的PBSPH正在 7.4-7.6 浓度是 0.01M

5)常用试剂的配制和运用。

正在免疫组织化学的染色历程中,用得最多的试剂就是缓冲液,由于切片正在全部染色中,抗体的加、换、切片的冲刷,DAB的配制皆离不开缓冲液。可见缓冲液正在全部染色中都起至要害的感化,缓冲液的过酸或偏偏碱,皆将影响染色的效果。

 

15 、脱片发生的缘由和怎样防备脱片?

1)多散赖氨酸玻片质量的题目。

2)构造切的欠好,切片机的题目比方对照老的旧的机械切的薄大概不均匀,大概切片者伎俩欠好等。

3)构造的题目,我用的构造癌症的许多,越是癌症构造有坏死之类越轻易脱。

4)没烤好,工夫短温度不敷之类。

5)操纵的时刻甩的太猛了,有脱片怀疑的电影最好不甩或悄悄甩,用卫生纸从边沿上逐步吸水。

6)修复的题目:抗原修复的时刻高压工夫过长了,大概放进 100 度的修复液时伎俩欠好,咚的一声就丢出来了,如许超轻易脱片。另外,用EDTA修复比柠檬酸轻易脱片,然则您要用到EDTA的时刻也出设施,只要从别的的题目上动手。

7)另外,一旦见到有组织漂起来操纵便越发要郑重,用PBS的时刻只管用泡的,不冲要。基本上把这些方面皆注重到了,能改进的只管改进,脱片能够削减许多。

 

16 、配景染色较深的缘由有哪些?

1)抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的缘由之一。解决办法是,每次运用新抗体前该当对其事情浓度停止测试,使每抗体个体化,找到合适本身实验室的幻想事情浓度,既使是即用型的抗体也应云云,不克不及只简朴的按说明书停止染色。

2)抗体孵育工夫过长或温度较下:解决办法是,严格执行操作规程,最好随身佩戴报时表或报时钟,实时提示,制止果忘记而形成工夫延伸。如今盛行的二步法(Polymer)敏感性很下,要求一抗孵育的工夫不是传统的 1 小时,而是 30 分钟,因而,要凭据染色效果停止调解。

3DAB变质和显色工夫太长:DAB最好现用现配,如有沉渣应停止过滤后再用。配制好的DAB不应寄存工夫太长,由于正在没有酶的状况下,过氧化氢也会游离出氧原子取DAB发生回响反映而低落DAB的效率,已用完的DAB寄存正在冰箱里几天后再用这类好像勤俭的设施是不可取的。DAB的显色最幸亏显微镜下监控,到达幻想的染色水平时立刻停止回响反映。不过当染色片太多时或用染色机时,如许做好像不现实,但最少应对一些新的或少用的抗体显色时停止监控,制止显色工夫过长。

4)构造变干:修复液溢出后已实时增补液体、染色切片太多、行动太缓、遗忘滴液、滴液流失等都是形成构造变干的缘由。处理的设施是操纵要卖力细致,接纳PAP Pen正在构造四周绘圈,能够有用的制止液体流失,也能进步操纵速度。

5)切片正在缓冲液或修复液中浸泡工夫太长(大于 24 小时):缘由上不清楚,但征象存在。

有的实验室喜好前一天将切片脱蜡至修复,第二天加抗体停止免疫组化染色,若是将装有切片和修复液的容器放正在 4oC冰箱留宿,对效果无显着影响,若是放正在室温,特别是酷热的炎天,会泛起配景着色,因而,弗成寄存工夫太长。

6)一抗变质、质量差的多克隆抗体:注重抗体的有效期,逾期的抗体要麽不显色要麽配景着色。用新买抗体时最好设立阳性对比和用运用过的抗体做对照。

 

17 、苏木素复染后氨水返蓝这一步怎样做、浓度若干、工夫多长?

答:返蓝能够用碱性溶液(PBS/Na2HPO4/浓氨水)或 45 度温水、冷水蓝化都可。一样平常蓝化 5~10 min。浓氨水有人用 50ml自来水+三四滴的氢氧化铵。